BACTERIAS

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN MICROBIOLOGÍA
Las bacterias son células procariotas que poseen pared celular, lo que permite diferenciarlas en grampositivas (constan de peptidoglucanos y ácidos teicoicos);
gramnegativos (con lipopolisacáridos, lipoproteínas y peptidoglicano)
y ácido -alcohol resistentes (con ácidos micólicos)

Las bacterias, según su relación con el oxígeno , se pueden dividir en aeróbias, anaeróbias (presentes en tracto genital femenino , colon y cavidad oral)  y microaerófilas, cuando crecen a bajas tensiones de oxígeno.

El diagnóstico microbiológico puede realizarse mediante técnicas directas basadas en demostrar la presencia del agente microbiano (visualización o cultivo)
*sus productos metabólicos o compuestos antigénicos (antigenuria para Legionella)
*Además , las técnicas de biología molecular permiten detectar secuencias de ácidos nucleicos específicos del microorganismo PCR.
*Las técnicas indirectas detectan anticuerpos circulantes o una sensibilidad retardada.

-Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos permiten orientar el tratamiento antibiótico adecuado.
Para ello,
la actividad antibiótica se puede determinar mediante la concentración mínima inhibitoria (menor concentración del antibiótico capaz de inhibir la multiplicación bacteriana) ,

concentración mínima bactericida (concentración mínima capaz de matar la misma cepa bacteriana)

y la capacidad bactericida del suero (mayor dilución del suero del paciente al que se administra un antibiótico capaz de matar la bacteria

ESTRUCTURA DE LA CÉLULA BACTERIANA
Las bacterias son un grupo heterogéneo de microorganismos unicelulares que se distinguen por poseer:
*Estructura celular de célula procariota.
*Transmisión de material genético de unas bacterias a otras mediante mecanismos de transferencia genética.

La célula procariota (bacterias) carecen de membrana celular , retículo endoplasmático o plastos autónomos (mitocondrias  y cloroplastos) ,
circunstancias que la diferencian de la célula eucariota (plantas, animales y protistas)
Las bacterias poseen una membrana citoplasmática de estructura similar a la eucariótica, con el modelo típico de bicapa fosfolipídica y matriz proteica; a diferencia de esta, su membrana carece de esteroles, salvo los Mycoplasmas.

                                                  PROCARIOTA    EUCARIOTA
Membrana nuclear                           No                          Si        

Cromatina                                        Un cromosoma      varios cromosomas

Retículo endoplasmático                  No                          Si

Lisosomas y Golgi                           No                           Si

Ribosomas                                        Si                            Si

Plastos autónomos
(mitocondrias, cloroplastos)             No                          Si

Citoesqueletos                                  No                         Si


Los elementos bacterianos se dividen en:
OBLIGADOS:
-Pared celular
-Membrana citoplasmática
-Citoplasma
-Ribosomas
-Núcleo

FACULTATIVOS
-Cápsula
-Glucocálix
-Flagelo
-Fimbria
-Esporo

PARED CELULAR
Es una estructura fundamental de la que sólo carecen el género Mycoplasma. Se trata del elemento obligado más extenso y forma una cubierta rígida que se encuentra separada de la membrana plasmática por el espacio periplasmático. Según su composición y estructura, cuenta con una serie de propiedades tintoriales que permite clasificar a las bacterias, por ejemplo mediante la tinción de Gram
La composición de la pared celular es diferente según se trate de bacterias grampositivas o gramnegativas, o bien ácido-alcohol sensibles o resistentes; sin embargo, tienen un elemento, común a todas ellas, que forman el auténtico esqueleto, el peptidoglucano. Está constituido por cadenas de aminoazúcares enlazados con polipéptidos.

                                       GRAMPOSITIVOS    GRAMNEGATIVOS
Tinción Gram                  Violeta                        Rosa

Decoloración                     No decoloración          Decoloran

Endo                                   No                                Sí  (lípido A)

Pared                                  Fina                              Compleja

Superficie                           Homogénea                 Rugosa

Lípidos                               +                                  +++

Ácido teicoico                     Sí                                 No

Sensibb B lactámico           Notable ++                   Escasa +

Sensibd lisozima                 Si                                    No

Relación ADN/ARN           8/1                               1/1

GRAMPOSITIVOS: El componente fundamental y más abundante es el peptidoglucano. Además, están presentes (específico de los grampositivos) los ácidos teicoicos, que se cree que se entrelazan con el peptidoglucano formando un armazón , impidiendo la penetración de ciertos antibióticos y que contribuyen a la adhesión a las superficies celulares. Los ácidos lipoteicoicos se insertan en la membrana plasmática por su parte lipofílica, interveniendo así en el mantenimiento de la integridad celular.

GRAMNEGATIVOS: En estos la proporción de peptidoglucano es mucho menor; La pared es más compleja en composición y estructura que los grampositivos.

Se distinguen tres zonas diferenciadas:

- Capa externa. Constituida por un lipopolisacárido que se divide en oligosacárido, externo (antígeno O) una parte central o core y una parte interna lipídica (Lípido A)  o endotoxina .

- Los fosfolípidos se unen a la parte hidrófoba del lipopolisacárido (lípido A) formando en conjunto una membrana externa donde se insertan proteínas (porinas). Las proteínas de membrana externa se sintetizan en los ribosomas y se piensa que se transfieren al exterior por unas zonas de adhesión entre membrana citoplasmática y membrana externa denominadas "uniones Bayer"

-Capa intermedia: Compuesta por la lipoproteína que se inserta en su parte lipídica con los fosfolípidos de la capa externa y en su parte peptídica con el peptidoglucano.

-Capa profunda: Está constituida por el peptidoglucano, de composición ligeramente diferente a la de los grampositivos

-ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES: Comprenden las micobacterias y algunas especies de Nocardia. La propiedad de no decolorar ante el ácido-alcohol reside en los ácidos micólicos , ácidos grasos no saturados que se pueden presentar esterificados con el polisacárido superficial fromando un factor de virulencia denominado cord-factor (glucolípidos). El resto es similar a los grampositivos, aunque no se han encontrado ácidos teitoicos.

Entre las funciones que desempeña la pared bacteriana , se encuentran:
*Exoesqueleto bacteriano: da rigidez y resistencia osmótica
*Forma el tabique en el caso de división bacteriana
*Función de filtro, con la presencia de las porinas que no dejan pasar macromoléculas.
*Poder patógeno en el caso de la endotoxina (lípido A) , propia de los gramnegativos.
*Confiere a las bacterias especificidad de tipo y de grupo, determinada por el antígeno superficial O.
*Es el sustrato sobre el que actuan ciertos antibióticos como los B-lactámicos.
*Define las propiedades tintoriales de las bacterias (tinciones de Gram y Ziehl-Neelsen)

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
Se trata de una membrana similar a la de las eucariotas, salvo que no posee colerterol (excepto Mycoplasma) y adopta una estructura de doble capa de fosfolípidos, con proteínas englobadas con diversas funciones (permeasas, fosfatasa alcalina, etc...)

En la superficie externa se localizan las PBP o proteínas fijadoras de penicilina (penicillin - binding proteins) que intervienen en la síntesis del peptidoglucano, y cuya mutación puede condicionar la resistencia a los B lactámicos, como ocurre en las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina.
Entre las propiedades que posee, destacan:
*Se trata de una barrera osmótica, con función de filtro selectivo por sus propiedades hidrófobas y sus proteínas (permeasas)
*En ella se realiza la fosforilación oxidativa, mientras que en las células eucariotas esta tiene lugar en las mitocondiras.
*Sintetizan la pared celular y otras estructuras externas como cápsula, dextranos del glucocálix etc.
*Sobre ella actúan agentes antimicrobianos y antisépticos (detergentes)

CITOPLASMA:
Es un sistema coloidal formado por agua y contiene el ADN bacteriano, ribosomas e inclusiones de naturaleza diversa.

RIBOSOMA:  Son estructuras fundamentales en la síntesis de proteínas y órgano diana de numerosos antibióticos (aminoglucósidos, tetraciclinas, macrólidos...) Tienen un coeficiente de sedimentación diferente al de los ribosomas de las eucariotas.

NÚCLEO:  A diferencia del de las células eucariotas, se trata simplemente del genoma celular, que equivale al cromosoma bacteriano, no limitado por una membrana y el ADN extracromosómico o plásmido.

ELEMENTOS FACULTATIVOS:
CÁPSULA: Constituida por polímeros orgánicos sintetizados por la propia bacteria y depositados fuera de la pared, habitualmente formada por polisacáridos, pero en ocasiones por polipéptidos (D-glutámico en Bacillus)

Entre sus propiedades y funciones, destacan:
*Protección frente a la fagocitosis, favoreciendo su multiplicación
*Capacidad antigénica , que ayuda a su identificación y a la preparación de vacunas
*Facilita la identificación , por el aspecto de la colonia y mediante la visualización al microscopio
*Protege a la bacteria de la acción de antibióticos al hacerse impermeable frente a estos.

GLUCOCÁLIX: Sustancia sintetizada por determinadas bacterias, contituida por homopolímeros que facilitan la fijación de la bacteria (S. epidermidis, Streptococcus del grupo viridans)

FLAGELOS: Son los responsables de la movilidad.  Están formados por un filamento de flagelina, responsable de la inmunidad específica de tipo  AgH. La modalidad por flagelos es excepcional en cocos.

FIMBRIAS: Son visibles al microscopio electrónico y carecen de movilidad . Entre sus funciones están adherencia, propiedades antigénicas y conjugación bacteriana.

ESPORO: Presente en algunas especies, puede permanecer de forma libre o dentro de la bacteria. Constituye una forma de resistencia bacteriana ante determinado estrés para el microorganismo.
Se compone de una parte central o core, con todos los elementos necesarios para convertirse en la forma vegetativa, y una parte externa, que consiste en una especie de peptidoglucano recubierto por capas ricas en queratina (intina y exina)

RECUERDA: En las infecciones por anaerobios localizadas en el abdomen, el metronidazol suele ser el tratamiento de elección con preferencia frente a los Blactámicos.

FISIOLOGÍA BACTERIANA:
Las bacterias se pueden clasificar desde el punto de vista nutricional:
según la fuente de obtención de energía:
-Fototrofas:  A partir de la luz solar
-Quimiotrofas:  A partir de reacciones químicas.
-Paratrofas: A partir del huésped que parasitan

*Según su capacidad de síntesis:
-Autrofobas:  Tienen una elevada dotación enzimática. Aprovechan el carbono y nitrógeno obtenidos a partir de compuestos inorgánicos.
-Heterótrofas: Poseen una menor capacidad de síntesis. Sólo aprovechan carbono y nitrógeno de compuestos orgánicos.
-Hipotrofas: Tienen una casi nula dotación enzimática. Viven a expensas de la célula huésped.

*Según su relación con el oxígeno:
Bacterias aerobias:
Sólo se multiplican en presencia de O2. Si se colocan en un medio de cultivo con poca superficie expuesta al aire (tubo) crecen en la superficie
Bacterias anaerobias: sólo crecen en ausencia de O2. En el ejemplo anterior crecerían en el fondo del tubo . Suelen estar presentes en abscesos y en infecciones del tracto genital (femenino, colon y cavidad oral)
Bacterias aerobias y anaerobias facultativas:
Crecen bien en ambos medios.
Bacterias microaerófilas: 
Sólo crecen a bajas tensiones de O2, en el ejemplo anterior crecerían debajo de la superficie.

RECUERDA: Bacterias aerobias y anaerobias facultativas: crecen bien en mabos medios.

GENÉTICA BACTERIANA:
El intercambio genético entre células procariotas es generalizado y conforma una de las principales características de diversidad genética de las bacterias. Los mecanismos mejor conocidos son:

*Transformación: Captación directa de ADN procedente de la bacteria donante (muerta)
*Conjugación: La bacteria donante construye una porción de ADN (plásmido) que cede a una bacteria receptora por medio de pilis.
*Transducción: Transferencia de ADN de una célula donante a una receptora por medio de un bacteriófago.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO:
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en reconocer un espectro clínico y demostrar la presencia del agente etiológico en el organismo o la huella inmunológica que puede dejar este en el paciente.

El diagnóstico clínico se confirma con el diagnóstico etiológico que ofrece el laboratorio de microbiología clínica.
Las técnicas diagnósticas directas: demuestran la presencia del agente microbiano , sus productos metabólicos o compuestos antigénicos.

Las técnicas de diagnóstico indirecto: detectan anticuerpos circulantes o una hipersensibilidad retardada, reflejo de una infección pasada o actual por un microorganismo.

A la hora del aislamiento , hay que tener en cuenta que aislar un determinado microorganismo no conlleva la conclusión de que este sea el productor de la enfermedad, sino que hay que descartar, dependiendo del sitio de la toma, una colonización anormal, un artefacto o una contaminación de la muestra.  En general, la demostración del microorganismo en lugares asépticos, como LCR o sangre, es más específica que en vías respiratorias altas, piel , frotis vaginal.

prueba de sangre:
hemocultivo debe ser asepsia absoluta y antes de la toma del medicamento
prueba de esputo: son buena aquellas muestras de menos de 10 células epiteliales y más de 25 leucocitos por campo.

Demostración del agente antimicrobiano:
Comprende visualización , cultivo, aislamiento e identificación comprobación de patogenicidad y sensibilidad  a antimicrobianos.

VISUALIZACIÓN:
-Exámen directo: útil para Borrelia, Plasmodium, espiroquetas, Trichomonas, etc

-Preparación en fresco: Trichomonas y parásitos intestinales.

-Campo oscuro: Empleado para la detección de Treponema en lesiones sospechosas de sífilis primaria y secundaria

-Raspaduras en KOH y calcoflúor. Detección de hongos.

-Reacción capsular. Para detectar Cryptococcus y neumococo en LCR

-Técnicas de inmunofluorescencia directa. Logra no sólo la visualización de microorganismos, sino también su identificación con anticuerpos específicos

-Tinciones. Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa, (plasmodium, Babesia, Toxoplasma, Pneumocystis jiroveci, Kinyoun (Nocardia, Cryprosporidium, Isospora) Giménez (Rickettsia y Legionella) , Dieterle (Legionella) PAS y placa- metenamina de Gomori (hongos) -


CULTIVO: Induce el crecimiento y reproducción in vitro de bacterias para observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioquímico e inmunológico
Entre los medios utilizados , destacan:
*Enriquecimiento. El número de bacterias se incrementa midiendo la flora asociada que limita su crecimiento
*Aislamiento: Su fin es aislar una determinada colonia.
*Diferenciales: Se usan para establecer diagnósticos diferenciales aprovechando propiedades como la oxidación- reducción de sustratos, la producción de gas, etc

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN: La identificación de una especie microbiana se efectúa mediante pruebas fisiológicas, bioquímicas o metabólicas, distintas para cada género bacteriano.
Para ello se utiliza el tipo de colonia formada, su morfología y propiedades y, una vez aislado el agente, se completa el estudio con pruebas bioquímicas, inmunológicas, etc.

COMPROBACIÓN DE PATOGENICIDAD:  En ocasiones, un germen aislado es un saprofito habitual y no hay que demostrar su patogenicidad, otras veces, puede ir asociado a determinadas propiedades bioquímicas o inmunológicas (E.coli enterohemorragicas crece selectivamente en medios con sorbitol, el serotipo III del neumococo es el más grave)


SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANOS: Las pruebas de sensibilidad frente a los antimicrobianos ayudan a la elección del tratamiento antibiótico adecuado, aunque la correlación entre la eficacia y la actividad in vitro no es siempre exacta. En cualquier caso, no debe administrarse un antimicrobiano al que la bacteria se ha demostrado resistente  in vitro. Los métodos de difusión en agar ofrecen  información cualitativa sobre la sensibilidad de un determinado patógeno a los antimicrobianos. Esta puede expresarse como sensible S resistente R e intermedia I. En infecciones graves , como la endocarditis, puede ser útil la determinación cuantitativa de la actividad antibiótica midiendo.

-Concentración mínima inhibitoria:  CMI
o la menor cantidad de antimicrobiano en microgramos/ml capaz de inhibir la multiplicación de una determinada cepa bacteriana.

-Concentración mínima bactericida: CMB o la menor concentración de antibiótico capaz de matar a la misma cepa, que no siempre coincide con la CMI , siendo en general más alta que esta.

-Capacidad bactericida del suero: CBS . Es la mayor dilución del suero de un paciente al que se administran antibióticos capaz de matar a la bacteria responsable, en condiciones estándar.

-Niveles séricos de antimicrobianos: Útil en casos de insuficiencia hepática o renal,  para evitar efectos adversos y para garantizar la eficacia del tratamiento cuando nos quepan dudas de la biodisponibilidad del antibiótico (en caso de no utilizar la vía intravenosa)

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO:
Su objetivo es demostrar la presencia del microorganismo en el sujeto: la más común es el cultivo. En ocasiones , un diagnóstico en menos de 24 horas resulta muy útil para la profilaxis , tratamiento etiológico, etc.  Son técnicas directas también aquellas en las que se pretende demostrar metabolitos o antígenos bacterianos. La principal ventaja es la rapidez,

Cómo algunos ejemplos, la prueba de aglutinación en partículas de látex se utiliza para la detección de antígenos de Haemophilus , meningococo, neumococo, Streptococcus B hemolítico del grupo B o Criptococcus y la inmunofluorescencia para Clamydia, Treponema pallidum, Legionella o Bordetella.

Las técnicas de biología molecular permiten detectar secuencias de ácidos nucleicos pertenecientes al microorganismo; entre ellas se encuentran la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o las sondas de ácidos nucleicos, Constituyen la técnica de elección en la encefalitis herpética, por ejemplo.

- MÉTODOS:

*Microscópicos: Visualización del agente   - TÉCNICAS: Tinciones: Gram , Ziehl- Neelsen, auramina... -Microscopía electrónica - Fluorescencia: directa, indirecta y anti C3

*Químicos: -Detección de metabolitos microbianos  - Cromatología en gas líquido.

*Inmunológicos: -Detección de antígenos microbianos   - Aglutinación en látex - Inhibición de la hemaglutinación - Enzimoinmunoensayo -Radioinmunoanálisis RIA
-Doble inmunodifusión.

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO:
Se basan en la demostración de anticuerpos circulantes o de una inmunidad de tipo retardado.

*Demostración de anticuerpos: El diagnóstico de infección activa o enfermedad se realiza siempre por un aumento de cuatro o más veces de los títulos en una segunda determinación, efectuada de una a tres semanas después de la primera.  El diagnóstico es generalmente retrospectivo en las infecciones agudas, mientras que en las de curso prolongado se establece durante la enfermedad. Si se tiene en cuenta que la IgM es la primera en aparecer y desaparecer, su demostración tiene validez diagnóstica de enfermedad reciente. El estímulo antigénico para producir anticuerpos puede caer si se administran antibióticos y puede elevarse de manera significativa en el caso de una recaída .

*Hipersesibilidad de base celular:  La hipersensibilidad retardada puede demostrarse con reacciones intradérmicas, como en el caso de la tuberculosis (en la que la intradermorreacción de Mantoux es el método diagnóstico utilizado para demostrar la infección por M tuberculosis ) o la Leishmaniasis (intradermorreacción de Montenegro)